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研究摘要：
肝癌手術后復發轉移的控制，是肝癌治療面臨的最主要挑戰。細胞免疫治療方法EAAL在大規模隨機臨床試驗中被證明可以降低肝癌術后復發率18%，使復發的危險率減少41％。在本研究中，我們將采用不同的治療方案，對EAAL配合手術、介入化療和局部栓塞等常規肝癌治療方法對復發和轉移及病人生存期的影響進行系統的臨床研究。在此基礎上，我們將進一步研究EAAL方法作用的可能機制，及肝癌特異性淋巴細胞的治療可行性。
名詞縮寫：
EAAL: expanded activated autologous lymphocytes, 擴增活化的自體淋巴細胞
CIK Cells: cytokine induced killer cells, 細胞因子誘導的殺傷細胞
TIL: tumor infiltrating lymphocytes, 腫瘤浸潤淋巴細胞
研究目的：
1. 在大規模隨機臨床試驗的基礎上，試驗EAAL方法作為免疫輔助治療，對手術和其它常規治療后病人復發和轉移的抑制作用；
2. 通過設計不同的EAAL使用療程和使用頻率，試驗該方法延長病人生存期的效果；
3. 在上述基礎上，研究EAAL方法可能的作用機制；
4. 通過引入腫瘤特異性淋巴細胞的方法，研究更有效的肝癌細胞免疫治療方法。
研究背景：
大多數肝細胞肝癌，特別是伴發肝硬化和其它一些癥狀的情況下，預后往往都很差。外科手術，包括腫瘤切除術或是肝移植，往往是肝癌治療的唯一手段。化療和腫瘤栓塞術只能緩解癥狀，對存活率和存活時間沒有顯著改善[1]。因此，尋找肝癌手術后預防轉移和復發的手段，成為肝癌治療的重要研究方向。
盡管大多數肝癌病人的預后不好，但越來越多的證據表明，免疫應答至少在部分肝癌病人中，對疾病的進展乃至病人的存活至關重要。
1. T淋巴細胞:
（1） CD8+ T細胞對肝癌細胞具有特異性識別殺傷作用：
較早的研究表明，與大量無T淋巴細胞的樣本相比，有T淋巴細胞浸潤的小肝癌的復發率低、5年生存率高。而且占優勢的浸潤淋巴細胞為CD8+的T淋巴細胞，而非CD4+的T淋巴細胞[2]。隨后，在肝癌組織中發現了特異性識別多種腫瘤相關抗原[3]、腫瘤特異性共享抗原[4]、自體抗原（AFP[5]和SART-1[6]）、病毒表位[7，8]的T細胞。CD8+ T細胞的浸潤與肝癌細胞的凋亡呈正相關[Eur J Surg Oncol. 2004 Feb;30(1):53-7. CD8+ lymphocyte infiltration and apoptosis in hepatocellular carcinoma.Ikeguchi M, Oi K, Hirooka Y, Kaibara N.]我們自己的工作證明，肝癌組織浸潤的CD8+ T細胞，在體外經過活化后，具有殺傷自身肝癌細胞的功能（未發表數據）。
（2） CD8+ T細胞可特異性識別殺傷具有干細胞特征的腫瘤細胞腫瘤干細胞被發現普遍存在于包括肝癌[ ]在內的多種惡性腫瘤組織中，并被認為是腫瘤常規治療后復發和轉移的直接原因[Cancer Cell Int. 2007; 7: 9. Role of stem cells in cancer therapy and cancer stem cells: a review Jayesh Sagar, Boussad Chaib, Kevin Sales, Marc Winslet, and Alexander Seifalian]。而另一方面，腫瘤干細胞同樣表達腫瘤特異性抗原，并可作為免疫治療的靶點，如前列腺癌細胞表達的前列腺干細胞抗原PSCA[ ]。最新的研究表明，多發性骨髓瘤（MM）的癌前病變MGUS常常表達胚胎干細胞參與自我更新的關鍵分子SOX2。而識別該分子特異性T細胞的存在提示癌前病變的良好預后。我們最近建立的一株干細胞樣肝癌細胞系中，發現該株細胞表達大量腫瘤特異性共享抗原，同時可被來源于同一病人自身的CD8+ T細胞特異性殺傷。這提示我們通過利用免疫治療殺傷腫瘤干細胞，可能達到控制腫瘤復發和轉移的目的。
（3） 輔助性CD4+ T細胞對移植后肝癌的復發有抑制作用有文獻表明，肝癌患者進行肝移植后，肝癌復發的危險率與CD4：CD8的比例呈正相關，但此種CD4+ T細胞為輔助性T細胞，而不是表達CD25分子的調節性T細胞（regulatory T cells）[9]。
（4） CD4+CD25+調節性T細胞可通過抑制CD8+ T細胞的作用促進肝癌細胞生長
存在于腫瘤邊緣位置及腫瘤浸潤性調節性CD4+CD25+T細胞具有抑制腫瘤特異性CD8+ T細胞增殖和活化的作用，成為肝癌細胞不受控制生長的原因之一[9，Hepatology. 2005 Apr;41(4):722-30. Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma: the role of T-regulatory cells.Unitt E, Rushbrook SM, Marshall A, Davies S, Gibbs P, Morris LS, Coleman N, Alexander GJ.]。此外，在肝癌病人的外周血中，其CD4+CD25+調節性T細胞也明顯增加，并于腫瘤局部CD4+CD25+調節性T細胞的浸潤呈正相關。這些調節性T細胞在體外與非調節性T細胞共同培養時，抑制后者的增殖和細胞因子的分泌[Cancer Res. 2005 Mar 15;65(6):2457-64.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma.Ormandy LA, Hillemann T, Wedemeyer H, Manns MP, Greten TF, Korangy F.]。
2. 細胞因子：細胞因子是調節機體天然免疫和獲得性免疫的關鍵因子。細胞因子環境的平衡對獲得保護性免疫（如抗病毒，抗腫瘤，抗細菌免疫）及避免病理性免疫（如自身免疫病）至關重要。一般來講，Th1 類細胞因子有利于抗腫瘤免疫，而Th2類細胞因子可能有抑制腫瘤免疫的作用。Budhu A等人最近報道，肝癌的局部轉移與局部組織的細胞因子為環境直接相關。相比于不利于肝內靜脈轉移的微環境（MAM），趨于肝內靜脈轉移的微環境中的細胞因子標簽出人意料地高表達Th2類細胞因子IL-4, IL-5, IL-8和IL-10，而明顯低表達Th1類細胞因子，包括IL-1A, IL-1B, IL-2, IFN-g和 TNF。在利用細胞因子進行的腫瘤治療試驗中，有證據表明，在作為細胞因子配合疫苗使用時，Th1類細胞因子，包括IL-2，-7，-12，-18，IFN-g，TNF-a及部分Th2 類細胞因子，包括IL-4，-6，可誘導抗腫瘤抗原特異性的免疫應答。在直接使用細胞因子進行惡性腫瘤的治療中，IL-2 和IFN-a，-g應用得最為廣泛。而在評價抗腫瘤免疫中，T細胞在識別腫瘤細胞后分泌IFN-g的量成為評價抗腫瘤免疫應答的最重要指標之一。
針對肝癌免疫應答的上述特性，適當的免疫治療方法有可能通過殺傷腫瘤細胞，包括腫瘤干細胞的方式，達到控制肝癌復發和轉移的目的。這需要解決兩方面的問題（1）有識別肝癌細胞的特異性殺傷性T細胞；（2）能夠改善患者體內免疫環境和免疫微環境，使控制和殺傷腫瘤細胞的免疫細胞能夠發揮功能。這包括降低CD4+CD25+調節性T細胞的數量，并使Th1/Th2細胞因子水平向Th1平衡。為此，我們擬采用細胞過繼免疫治療---擴增活化的自體淋巴細胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)的方法，探索免疫治療對肝癌復發和轉移的預防性效果和對病人生存率、生存期的影響。
腫瘤免疫治療的主要手段之一，細胞過繼免疫治療，是通過離體擴增病人自身特異性或非特異性淋巴細胞、擴增并回輸的過程，來滿足上述條件，達到殺傷和/或控制腫瘤細胞的目的。這種方法建立于T細胞活化分子白細胞介素2 (IL-2)的發現，包括腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）方法，LAK（Lymphokine-induced Killer）細胞、CIK （Cytokine-induced Killer）細胞和EAAL。這些方法最主要的不同在于培養前所使用的細胞、培養后所獲得的細胞種類不同、培養效率和臨床效果不同（表1）。
表1. 不同細胞過繼免疫治療方法的比較
細胞免疫治療名稱
TIL
LAK
CIK
EAAL
起始細胞類型/數量
腫瘤浸潤淋巴細胞
PBMC，3000-5000ML*
PBMC，3000-5000ML*
PBMC，20-100ML
產出細胞主要類型
CD8+ T細胞
NK細胞
CD3+CD56+ T細胞（〉50%）
CD8+ T細胞：63.0±24.6%
CD4+CD25+ 調節性T細胞
無相關報道
無相關報道
無相關文字報道，口頭報告數據：20-50%
1.7±1.1%
擴增倍數
無相關報道
無相關報道
1-10倍
100-1000倍以上
產出細胞特異性
腫瘤特異
非特異
非特異
ND
臨床試驗有效性
晚期惡性黑色素瘤消退腫瘤作用可達70%[ ]
血液腫瘤
血液腫瘤
降低41% 肝癌術后復發危險率[ ]
副作用
白化病（自身免疫病）
無相關報道
無相關報道
主要為自限性低熱，未見II級以上副作用
PBMC：外周血單個核細胞
ND：未檢測
*使用單個核細胞采集機分離病人相當于此體積的PBMC。
二十世紀八十年代，Steven Rosenberg等開始在體內或體外利用IL-2刺激機體的T淋巴細胞，治療轉移的惡性黑色素瘤（惡黑）和腎癌。在早期的研究中，大劑量IL-2直接給予病人。在對567名惡黑患者的臨床試驗研究中，21％的病人有臨床效果12。然而，大劑量IL-2的治療同時帶來了嚴重的副作用，包括腎衰、嚴重的口炎和全身反應等。2002年，Rosenberg等報道了一種新的細胞過繼回輸方法，進行腫瘤的免疫治療13。他們在體外篩選出具有病人自身惡黑細胞特異性殺傷作用的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs），大量擴增后回輸給自體病人。在這種方法中，經過體外IL-2和抗CD3抗體的聯合作用，數量高達1011的、腫瘤細胞高度特異的TILs被回輸至病人體內，這些細胞以CD3+CD8+CD56-的T細胞的為主。在接受治療的13例病人中，6例病人完全緩解，4例病人部分緩解。這10例病人均發生明顯的腫瘤縮小和/或消失。這個報道，重新燃起了免疫學家和臨床醫生對細胞過繼治療腫瘤的熱情。然而，TIL過繼回輸的方法在很大程度上受到腫瘤細胞原代培養的成功率、腫瘤特異性浸潤細胞的可獲得性、體外擴增能力、體外培養后功能的可維持性的限制。因此，這個方法長期以來難以在臨床實施推廣。最近，在傳統的抗CD3抗體和IL-2體外擴增活化淋巴細胞（細胞因子誘導的殺傷細胞，CIK細胞）方法的基礎上，日本國立癌癥研究院關根暉彬（Teruaki Sekine）博士開發了一種新的腫瘤免疫治療的方法---擴增活化的自體淋巴細胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)。在這種新的方法中，使用的淋巴細胞來源于病人自身的少量外周血（20-100ml）。在約2周的短時間內，這些淋巴細胞可以活化擴增達1000倍后，再回輸于病人體內。在一項歷經約10年的大規模隨機臨床試驗中，經過EAAL治療的肝癌術后患者，與不經該治療的對照組相比，肝癌術后復發率降低18%，復發的危險率減少了41％[ ]。此外，初步的數據顯示，該方法對于惡性腦腫瘤具有一定的預防復發和轉移、延長病人生存期的效果[ ]。
機體內的T淋巴細胞包括許多針對不同抗原的特異性細胞。其中一部分細胞經過培養后，會針對不同的腫瘤抗原/病毒抗原具有廣泛的識別和殺傷效果。我們的初步研究結果顯示，EAAL具有以下特點，使之成為具有抑制腫瘤復發轉移的可行性治療方法。
1． EAAL的主要細胞類型為殺傷性淋巴細胞：
在體外擴增激活后的EAAL細胞，其主要成分（表2）包括（1）CD3＋CD56＋（約10％）細胞，它們既具有自然殺傷細胞特征、又具有T淋巴細胞特征的細胞群體；（2）CD8+的殺傷性T淋巴細胞（約50 - 70％）；（3）NK細胞（約10%）。CD3+CD56+細胞中的一部分可識別在部分腫瘤細胞中改變的糖類抗原；CD8+ T淋巴細胞為機體最主要的抗腫瘤淋巴細胞群體，其中可有識別多種不同腫瘤抗原/病毒抗原的特異性殺傷性T細胞，對腫瘤細胞或病毒進行殺傷；NK細胞對HLA表達下調的腫瘤細胞有直接的殺傷作用。
表2. EAAL細胞培養前后細胞類型的變化
細胞表面分子
培養前的百分比
（均值）
培養后的百分比
（均值）
CD3+CD4+33.2
10.6
CD3+CD8+
22.8
63.0
CD3+CD56+
5.4
11.7
CD3-CD16+
12.6
11.8
CD4+CD25+
3.3
1.7
2． EAAL中CD4+CD25+ 抑制性T細胞的百分率低于外周血水平：
經過EAAL方法擴增活化的自體淋巴細胞，回輸的細胞中CD4+CD25+ 抑制性T細胞的百分率僅約1.7±1.6%。因此，細胞回輸后不會增加免疫抑制性淋巴細胞，有利于細胞毒性淋巴細胞發揮其抗腫瘤作用及分泌Th1類細胞因子。
3． EAAL分泌的細胞因子以Th1類細胞因子為主：
經過培養的EAAL細胞，在經過活化后，其分泌的細胞因子主要為Th1類細胞因子，尤其是對腫瘤、病毒等具有殺傷功能的細胞因子IFN-γ和TNF-a（圖1）。這些細胞因子將有利于淋巴細胞對腫瘤細胞的直接殺傷以及機體免疫環境克服由腫瘤引起的免疫抑制。
4． 回輸EAAL后機體免疫細胞和免疫環境的變化趨向于Th1
1) 提高腫瘤患者體內抗腫瘤細胞因子γ干擾素 (IFN-γ) 的水平。
在使用EAAL方法治療的腫瘤患者體內，回輸后，其分泌抗腫瘤細胞因子IFN-γ的淋巴細胞數目明顯增多 (圖2，左)。同時，分泌IFN-γ的量明顯上升 (圖2，右)。
IFN-γ除本身具有抑制和殺傷腫瘤的作用外，對機體免疫系統還具有重要的調節作用。它可使免疫系統的功能趨向于Th1方面平衡，即發揮殺傷性功能。而腫瘤病人體內由于腫瘤分泌的免疫抑制因子的作用，機體免疫環境多為免疫殺傷抑制性環境，阻礙了殺傷性淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷。因此，EAAL在抗腫瘤治療的作用機制除直接殺傷或抑制腫瘤生長外，可能還包括改善患者體內的免疫抑制性環境，優化腫瘤殺傷的免疫環境 (見下文2))。
2) 調節腫瘤患者免疫系統，明顯提高具有抗腫瘤作用的淋巴細胞在免疫系統中的比例。
EAAL回輸后，病人外周血淋巴細胞中CD8+ T細胞的比例明顯上升 (圖3)，CD4+ T細胞與CD8+ T細胞的比例明顯下降 (圖4)。說明病人的免疫系統趨向于向免疫殺傷功能的淋巴細胞平衡。
EAAL自體回輸治療，在日本已經進行了上萬例病人的治療。其主要副作用為自限性低熱（47%，約37.5°C）。其它所觀察到的副作用均為1或2級并且具有自限性，未有患者出現肺或腎部的癥狀、任何跡象的感染、肝功能衰退或自身免疫失調反應。
利用EAAL免疫細胞治療腫瘤的方法與手術，放化療相比，雖然在臨床上可見其縮小腫瘤結節的效果，但對大的腫瘤殺傷效果不如其它治療方法。而在另一方面，免疫治療對預防癌癥復發、控制腫瘤生長的效果和對患者生存質量（QOL，quality of life）改善效果比較好。不僅如此，在與放化療配合使用時，免疫治療與放化療具有協同作用。因此，免疫治療方法較好的適應癥，應當是用于手術后和/或配合常規放化療，達到預防腫瘤復發、轉移，提高患者生活質量的目的。
國內目前很多醫院采用傳統的CIK細胞進行實體瘤的免疫治療。在使用過程中我們發現，傳統CIK細胞培養方法存在以下不足：
（1） 缺乏大規模隨機臨床試驗對實體瘤治療效果的評價。
（2） 對病人免疫系統損傷較大、導致病人對放化療耐受性差：
傳統的CIK細胞培養，需要經過淋巴細胞分離儀，獲取3000－5000ml病人外周血量的淋巴細胞，相當于病人全身循環血中的淋巴細胞。經過這樣的淋巴細胞采集過程，病人體內的淋巴細胞計數大幅度降低，免疫力較差，對放化療的耐受差，身體狀況受到較大影響。在CIK細胞與放化療聯合治療時，效果不好。
（3） 培養效率低：
傳統的CIK細胞培養，體外活化后，細胞的擴增效率一般為5倍左右。擴增效率的低下，是起始細胞數要求多的一個重要原因。因此，提高細胞活化擴增的效率，是傳統CIK細胞培養方法需要改進的一個重要方面。
（4） 培養后的細胞含大量CD4+CD25+免疫抑制性T細胞群體，在體內、體外可抑制抗腫瘤免疫應答。
傳統CIK細胞培養方法，在獲得大量CD3+CD56+的CIK細胞同時，還有約30％左右的CD4+CD25+ T細胞。這種細胞群體被稱為調節性T細胞，其在體內體外的功能是抑制淋巴細胞的增殖、活化。這群細胞的比例增大，不利于具有抗腫瘤免疫功能的其它淋巴細胞群體的增殖及功能的發揮。因此，降低細胞培養體系中這群抑制性T細胞的比例，將有效提高具有正常殺傷免疫功能的T細胞的活化、增殖及其功能。
（5） 細胞穩定性較差
細胞收獲1－2小時內不能馬上回輸，細胞就會死亡。
（6） 由于細胞采集的原因，不能進行高頻治療
（7） 付出淋巴細胞分離的額外費用（3800元/次）
（8） 整個細胞培養過程步驟繁瑣、人為因素多、可控性差、重復性差、不適合規模化生產
而我們選擇EAAL療法作為我們臨床試驗選擇的腫瘤免疫治療方法，關鍵基于這種改進的方法相比較于傳統的CIK細胞培養方法具有革命性的優勢：
（1） 治療的安全性：
該療法在日本已經完成了超過2000例病人的臨床治療。副作用以自限性低熱（37－38°C）為主，所觀察到的副作用均為1或2級并且具有自限性，未有患者出現肺或腎部的癥狀、任何跡象的感染、肝功能衰退或自身免疫失調反應。
（2） 治療的有效性：
根據The Lancet（柳葉刀，2000: 356（9232）：802-807）的報道，在日本進行的肝癌手術后大規模隨機臨床試驗中，使用EAAL進行的免疫治療可提高患者的無復發存活率：與對照組相比，免疫治療組出現首次復發的時間要明顯延長（p=0.008）。與無該治療的病人相比，EAAL治療組肝癌術后復發率降低18%，復發的危險率減少了41％（p=0.01）。
（3） 細胞擴增的高效性和高活性：
EAAL方法的細胞的擴增效率約為200-1000倍，保證少量外周血即可達到所需細胞數目。其培養后活率在95％以上，12小時內細胞活率沒有降低，24小時內細胞活率降低約5％，細胞質量穩定，細胞制劑可長途運輸。
（4） 細胞產品質量的可控性和細胞產品規范生產的可操作性
本試驗所采用的細胞培養試劑為批量生產的EAAL培養試劑系統，包括從基本培養基的配置、抗體和細胞因子的添加，均采用了嚴格的標準化試劑和細胞培養用一次性耗材的供應、質量控制、批次一致性等的質量保證系統。同時建立了細胞培養的標準化操作流程。在此標準化系統下進行的細胞培養，細胞的擴增效率約為200-1000倍，活率在90％以上，12小時內細胞活率沒有降低，24小時內細胞活率降低約5％，細胞類型主要以CD8+ T細胞為主（50-70％），CD3+CD56+ T細胞約為20-30%, 系統操作過程中實行嚴格的系統無菌控制，細胞培養體系為密閉體系，保證細胞產品無細菌、霉菌、支原體、病毒等任何微生物和內毒素的污染，使細胞產品有質量可控性。而系統的使用中無需人工添加任何試劑，將人為干擾因素和不確定因素降至最低，使細胞產品具有規范生產的可操作性。
腫瘤的免疫治療基礎，是機體的免疫系統具有監視和殺傷腫瘤細胞的能力。在臨床上，腫瘤的自發性消退雖不常見，但的確存在。相比較于化療和放射治療，腫瘤免疫治療具有特異性高，副作用小的特點。理論上來說，每一位腫瘤病人都可從免疫治療中獲得益處，并且早期病人由于機體免疫系統尚未受到腫瘤的嚴重影響，對免疫治療的應答較好，療效相對也會加強。而目前免疫治療的對象往往是晚期無法進行其它治療的病人。即使在這些病人群體中，免疫治療所顯現的療效，已足以使其成為繼手術、放化療之后的第四種腫瘤治療手段。
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